박테리아 유전체 재구성에 대한 연구 동향

연세대학교 김지현 교수

1. 개요

J. Craig venter박사는 자가 복제(self-replication)가 가능한 인공합성 세포 개발을 목표로 2003년 작은 바이러스를 합성하였고, 2010년에는 작은 박테리아 염색체를 합성하는데 성공하였다. 인공합성 유전체를 개발하는 것이 중요한 만큼 실제로 존재하는 박테리아 유전체를 재구성하여 원하는 생산물을 만드는 연구 또한 합성생물학 발전에 중요한 연구 방향이라 할 수 있다.
박테리아 염색체 구조는 Ori domain과 Ter domain의 크게 두 가지로 구성된다<그림 1>. 염색체의 복제개시에 관여되는 Ori domain은 일반적으로 oriC 뿐만 아니라 이에 특이적으로 결합할 수 있는 dnaA 단백질과 함께 복제에 관여되는 유전자를 포함한다. 많은 박테리아에서 보존되어 있는 복제 시스템은 oriC에서 시작되어 복제 방향이라 불리는 좌우 replichore를 따라 진행되며, ter/tus 유전자로 구성된 Ter domain에서 replication fork가 만나 종결된다 (Emilie, 2007).
수많은 유전자로 구성된 박테리아 유전체 정보와 합성생물학 도구들을 바탕으로 유전체 재구성에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 본 연구동향에서는 세포의 복제와 세포분열에 관여하는 유전체 재구성 연구를 바탕으로 cell viability 및 세포생장 양상 변화에 대한 연구 결과 및 동향에 대하여 소개하고자 한다.

<그림 1> Macrodomain organization of the E. coli chromosome (Esnault, 2007)

2. Bacteriophage의 telN/tos system을 이용한 유전체 재구성

2013년도 ACS Synthetic Biology 논문에서는 E. coli의 single circular 유전체를 재구성하기 위하여 <그림 2a>와 같이 염색체가 2개 이상인 세균으로 알려진 Vibrio spp.의 DNA 복제 개시 유전자와 bacteriophage N1의 tos site를 유전체 내 intergenic 부분에 도입하고 protelomerase 유전자인 telN을 발현시켜 세포 내에서 2 개의 linear 유전체를 생산할 수 있는 strain 22를 재조합하였다.
<그림 2> 표에 나타낸 바와 같이 E. coli 유전체 내 tos가 도입된 위치에 따라 세포의 viability에 영향을 준다는 것을 알 수 있다. E. coli의 single circular 유전체를 multiple 유전체로 생산 가능한 기술을 바탕으로 하나의 세포 내에서 Vibrio spp.와 같은 복제 시스템을 유도한 연구 결과이다.

<그림 2> Chromosome fragmentation strategies (Liang, 2013)
           a, tos/protelomerase(telN)를 이용한 fragmentation; b, Pulse-field
           gel electrophoresis을 이용한 유전체 구조 분석; c, 생장속도 측정

3. Macrodomain의 inversion에 의한 유전체 재구성

Ori와 Ter domain 두 macrodomain의 inversion을 유도한 후 E. coli 유전체를 재구성하는 방법으로 복제 방향을 나타내는 replichore의 inversion으로 유전체를 재구성하는 연구도 진행되었다. E. coli 유전체 내 여러 유전자 위치에 attB와 attP를 삽입한 뒤 Int/Xis system을 이용하여 inversion을 유도하고 lacZ integrity에 의하여 발현되는 β-galactosidase의 활성화로 inversion된 유전체를 확인하였다.

<그림 3B>에서 나타낸 것과 같이 recA(recombinase), tus(terminstion protien) 유전자와 좌우 replichore의 비율이 cell viability와 cell growth에 영향을 주는 것을 확인하였다. E. coli 유전체 재구성을 유도할 수 있는 합성생물학 도구와 유전체 구조의 balance가 중요하다는 것을 보여주는 연구 결과이다. 

<그림 3> Imbalance of replication arms (Esnault, 2007)
  A, E. coli chromosome replicore structure (replication arms, red arrow; replication fork,

 yellow; ten ter sites, black A to J); B, Colonies of imbalance strains; C, Co-culture assay를

이용한 성장속도 분석

4.  유전체 복제시스템 재구성

I. 복제 개시점(oriC) 삽입을 통한 재구성(DnaA-dependent)

여러 개의 복제개시점을 갖는 eukaryotes와 archaea와는 달리 박테리아는 하나의 복제 개시점인 oriC를 가지며 양방향 복제가 시작된다. 2011년도 Xindan의 연구팀은 대장균 염색체 내 lacZ유전자의 upstream 부분에 WT oriC를 삽입하고 oriZ라 명명하였다. 이 결과 각각의 oriC, oriZ위치에서 독립적인 양방향 복제 시스템이 일어나는 것을 replisome 분석을 통하여 확인 하였고, time lapse microscopy를 통하여 세포분열에 대한 현상을 연구하였다 <그림 4>. 이 연구는 E. coli 의 유전체 재구성을 통하여 eukaryotes와 archaea 같이 여러 복제개시점을 보유할 수 있는 가능성과 세포 복제와 분열을 실시간으로 분석할 수 있는 연구 방법을 제시한 논문이다.

<그림 4> 세포 복제(A)와 분열(B)에 대한 패턴 분석 (Wang, 2011)
WT E. coli cells (oriC), cells with two replication origins (oriC-oriZ),
and cells with only the ectopic origin (oriZ)

II. 복제 개시점(oriC) 제거를 통한 재구성(DnaA-independent)

염색체 복제는 일반적으로 복제개시점인 oriC의 위치에 특이적으로 결합할 수 있는 dnaA 단백질에 의하여 복제 개시가 이루어진다고 알려져 있다. 최근 흥미로운 연구로 E. coli 복제개시 유도 인자인 dnaA나 oriC를 제거하였을 때 세포가 복제를 시작하지 못하기 때문에 세포가 살아갈 수 없지만, oriC와 DNA translocase(recG), Tus, RNA polymerase(rpoB)를 함께 제거하면 stable DNA replication(SDR)이 유도되어 replication fork collide(R-loop)를 일으키기 때문에 세포가 생장하게 된다는 연구 결과이다.

2013 Nature 저널에 발표된 이 연구는 NGS 서열 분석을 기반으로 한 replication profile을 통하여 복제개시 부위에 위치한 DNA 단편이 높은 빈도 값으로 나타나는 현상이 replication fork collide(R-loop)가 유발되는 부위에 대해서도 동일한 패턴으로 나타남을 규명하였다 <그림 5>. 그 외 E. coli 연구뿐만 아니라 여러 개의 복제개시점을 갖는 archaea로 알려진 Haloferax volcanii의 유전체 내 모든 복제개시 부위의 제거를 통하여 세포 생장이 7.5% 빨라지는 재조합 균주가 구축될 수 있음을 결과로 제시하였다 <그림 6>

          <그림 5> DnaA-independent replication     <그림 6> Characterization of origin deletion in H.

                         (Rudolph, 2013)                                        volcanii strains (Hawkins, 2013)
            a, DNA replicore 배열;                                  a-f, oriC 제거 균주 replication profile 분석; 
            b, dnaA 또는 oriC 유전자가 파괴된                 g, Co-culture assay를 이용한 성장속도 분석

                돌연변이 균주의 생장 분석;
            c, Replication profile

5. 고찰

유전체 정보를 활용한 미생물 대사회로의 재구성과 유용 유전자 발굴의 지속적인 연구를 위한 미생물 유전체 재구성 기술들은 세포 복제와 분열에 최적화된 균주 개발을 가능하게 할 것이며, 이를 활용한 지능형 바이오시스템 구축을 통하여 고속 생장 미생물 플랫폼 기술 설계 및 합성을 성공적으로 수행할 수 있을 것이다. 또한 이를 통해 다양한 바이오산업 분야 의 생산성 증대를 기대할 수 있을 것이다.

<참고문헌> 
1. Xiquan Liang, Chang-Ho Baek, and  Federico Katzen, Escherichia coli with two linear

    chromosomes, 2013 ACS Synth. Biol., 2, 734-740
2. Xindan Wang, Christian Lesterlin, Rodrigo Reyes-Lamothe, Graeme Ball, and David J.

    Sherratt, Replication and segregation of an Escherichia coli chromosome with two

    replication origins, 2011 PNAS 26, 243-250
3. Emilie Esnault, Michéle Valens, Olivier Espéli, and Frédéric Boccard, Chromosome

    structuring limits genome plasticity in Escherichia coli, 2007 PLoS Genet, 3, 2486-2499
4. Christian J. Rudolph, Amy L. Upton, Anna Stockum, Conrad A. Nieduszynski, and Robert G.

     Lloyd, Avoiding chromosome pathology when replication forks collide, 2013 Nature 500,

     608-611
5. Michelle Hawkins, Sunir Malla, Martin J. Blythe, Conrad A. Nieduszynski, and Thorsten Allers,

    Accelerated growth in the absence of DNA replication origins, 2013 Nature 503, 544-547