Cellulose Binding Domain À¶ÇÕ¿¡ ÀÇÇÑ È¿¼Ò ´Ü¹éÁú ¾ÈÁ¤È
Çѱ¹»ý¸í°øÇבּ¸¿ø ±èÇϼº ¹Ú»ç
Soo-Jin Yeom, Gui Hwan Han, Moonjung Kim, Kil Koang Kwon, Yaoyao Fu, Haseong Kim, Hyewon Lee, Dae-Hee Lee, Heungchae Jung, Seung-Goo Lee. Controlled Aggregation and Increased Stability of¥â-Glucuronidase by Cellulose Binding Domain Fusion, Plos One, 2017.
1. ¿¬±¸¹è°æ
Cellulose binding domains (CBDs) ´Â cellulose ºÐÇØÈ¿¼ÒÀÇ ÀϺΠµµ¸ÞÀÎÀ¸·Î º¹ÇÕü¸¦ Çü¼ºÇÏ¿© ±âÁú ±Ùó È¿¼ÒÀÇ ³óµµ¸¦ Áõ°¡½ÃÅ´À¸·Î¼ È¿¼Ò È°¼ºÀ» ³ôÀÌ´Â ¿ªÇÒÀ» ÇÑ´Ù. º» ¿¬±¸±×·ìÀº ±âÁ¸ ¿¬±¸¿¡¼ Cellulomonas fimi À¯·¡ÀÇ family II CBD¸¦ Escherichia coli À¯·¡ ¼¼Æ÷Áú ´Ü¹éÁú°ú À¶ÇÕÇÒ °æ¿ì È°¼ºÇü À¶ÇÕü¸¦ Çü¼ºÇÔÀ» º¸¿´°í [1, 2] À̹ø ¿¬±¸´Â È¿¼Ò È°¼ºÀ» Áõ°¡½ÃÄÑÁÖ´Â »õ·Î¿î Matrix·Î¼ CBDÀÇ °¡´É¼ºÀ» °ËÁõÇÑ ¿¬±¸ÀÌ´Ù. ¿¬±¸¿¡¼ »ç¿ëÇÑ Å¸±ê È¿¼Ò´Â in vitro¿¡¼ Áøȱâ¹Ý ´Ü¹éÁú ¿¬±¸¿¡ ¸ðµ¨ ½Ã½ºÅÛÀ¸·Î ³Î¸® ¿¬±¸µÇ´Â È¿¼ÒÁß ÇϳªÀÎ E. coli À¯·¡ beta-Glucuronidase (GusA) ÀÌ´Ù [3, 4]. GusAÀÇ È°¹ßÇÑ ¿¬±¸¿¡µµ ºÒ±¸ÇÏ°í ÀÌ ´Ü¹éÁú ÀÚüÀÇ ºÒ¾ÈÁ¤¼ºÀ¸·Î ÀÎÇÑ ³ôÀº false positive ºñÀ²ÀÌ °í¼Ó ½ºÅ©¸®´×ÀÇ ÇÑ°è·Î ÁöÀûµÇ°í ÀÖ´Ù [4]. º» ¿¬±¸´Â ÀÌ·¯ÇÑ GusA¸¦ CBD¿Í À¶ÇÕÇÑ GusA-CBD ´Ü¹éÁúÀÇ È°¼º ¹× Ư¼ºÀ» ºÐ¼®ÇÏ¿© free GusA¿Í ºñ±³¸¦ ¼öÇàÇÏ¿´°í °á·ÐÀûÀ¸·Î family II CBD ´Ü¹éÁúÀ» À¶ÇÕ ÆÄÆ®³Ê·Î »ç¿ëÇÏ¿© GusA¿Í °°Àº Ÿ±ê È¿¼Ò ´Ü¹éÁúÀÇ ¾ÈÁ¤¼ºÀÌ °ÈµÇ°í È°¼ºÇü È¿¼Ò °íÁ¤È matrix·Î ÀÀ¿ë °¡´É¼ºÀÌ ³ôÀ½À» º¸ÀÎ ¿¬±¸ÀÌ´Ù.
2. ¿¬±¸°á°ú
GusA-CBDÀÇ ÀÚ°¡Á¶¸³ (Self-assembly) Çö»ó
GusAÀÇ C¸»´Ü°ú N¸»´Ü¿¡ CBD¸¦ À¶ÇÕÇÑ GusA-CBD¿Í CBD-GusA, ±×¸®°í free GusA¸¦ Àú¿Â¿¡¼ ¹ßÇö ÈÄ His-tag Á¤À縦 ¼öÇàÇÏ¿© specific activity¸¦ ÃøÁ¤ÇÑ °á°ú °¢°¢ ¾à 102, 19, 4.3 units mg-1·Î ³ª¿Í ÀÌÈÄ À¶ÇմܹéÁú ½ÇÇèÀº GusA C¸»´Ü¿¡ CBD°¡ À¶ÇÕµÈ GusA-CBD·Î ¼öÇàÇÏ¿´´Ù. Gel filtration chromatography¸¦ ÀÌ¿ëÇÑ native molecular mass ÃøÁ¤ °á°ú GusA¿Í GusA-CBD °¢°¢ 290¿Í 83000 Da·Î GusA´Â tetramer·Î GusA-CBD´Â monomer·Î Á¸ÀçÇÏ´Â °ÍÀ¸·Î °üÃøµÇ¾ú°í ÀÌ´Â CBD À¶ÇÕÀÌ oligomerizationÀ» ¾î·Æ°Ô ÇÏ´Â °ÍÀ¸·Î ÆǴܵǾú´Ù (±×¸² 1).
±×¸² 1. Gel filteration chromatography¸¦ ÀÌ¿ëÇÑ native GusA¿Í GusA-CBD¸¦ ÀÌ¿ëÇÑ molecular mass ÃøÁ¤.
ƯÁ¤ Á¶°Ç¿¡¼ Á¤ÀçµÈ CBDÀÇ °æ¿ì ÀÚ°¡Á¶¸³ (self-assembly) Çö»óÀ» º¸ÀÌ°í GusA-CBDµµ µ¿ÀÏÇÑ Æ¯¼ºÀÌ ÀÖ´ÂÁö °ËÁõÇϱâ À§ÇÏ¿© Á¤ÀçµÈ GusA-CBD¸¦ 4oC¿¡¼ 12½Ã°£µ¿¾È ó¸®ÇÏ¿´°í gel filtration chromatography¸¦ ÀÌ¿ëÇÑ ºÐ¼® °á°ú È¿¼Ò À¶ÇÕü·Î¼ ÀÚ°¡Á¶¸³ Çö»óÀÌ º¸ÀÓÀ» È®ÀÎ ÇÏ¿´´Ù (±×¸² 2)
±×¸² 2. Native GusA-CBDÀÇ ºÐÀÚ·®°ú (Red) 4µµ 12½Ã°£ ó¸® ÈÄ oligomer GusA-CBD (Blue)
ÀÚ°¡Á¶¸³µÈ GusA-CBDÀÇ È°¼º °ËÁõ
GusA´Â ´Ù¾çÇÑ »ó¿ë ±âÁúµéÀ» ÀÌ¿ëÇÑ ½¬¿î assay¹ý¿¡ ÀÇÇØ ³Î¸® »ç¿ëµÇ´Â ¸®Æ÷ÅÍ Áß ÇϳªÀÌ´Ù. º» ¿¬±¸¿¡¼´Â È°¼ºÈ ÃøÁ¤ ±âÁú·Î pNP-glucuronide¸¦ »ç¿ëÇÏ¿´°í GusA-CBDÀÇ ÇØ´ç ±âÁú¿¡ ´ëÇÑ È¿¼Ò È°¼ºÀÇ ÃÖÀû pH¿Í ¿Âµµ¸¦ ÃøÁ¤ÇÏ¿´´Ù. ±× °á°ú free GusAÀÇ ÃÖÀû ¿Âµµ¿Í pH°¡ 60µµ¿Í 7.5ÀÎ ¹Ý¸é GusA-CBDÀÇ °æ¿ì 60~70µµ¿Í pH6.0ÀÇ ÃÖÀû ¿Âµµ ¹× pH¸¦ °®´Â °ÍÀ» °üÂûÇÏ¿´´Ù (±×¸² 3).
±×¸² 3. Free GusA (red)¿Í GusA-CBD (black)ÀÇ pNP-glucuronide¿¡ ´ëÇÑ ÃÖÀû È°¼º ¿Âµµ ¹× pH ºñ±³
À§ °á°ú¿¡ ÀÇÇϸé GusA-CBD´Â free GusA¿¡ ºñÇØ ³ôÀº ¿Âµµ ¹× ³·Àº pH¿¡¼ ÃÖÀûÀÇ È°¼ºÀ» º¸À̸ç ÀÌ´Â ÇØ´ç Á¶°Ç¿¡¼ ´õ ¾ÈÁ¤ÇÏ´Ù´Â °ÍÀ» ¾Ï½ÃÇÑ´Ù. ÀÌ¿¡ ¿°ú pH¿¡ ´ëÇÑ ¾ÈÁ¤¼ºÀ» ºñ±³Çϱâ À§ÇØ ´Ù¾çÇÑ ¿Âµµ¿¡¼ µÎ ´Ü¹éÁúÀÇ half life¸¦ ºñ±³ÇÑ °á°ú GusA-CBD°¡ GusA¿¡ ºñÇØ 45, 50, 55, 60µµÀÇ ¿Âµµ¿¡¼ ¸ðµÎ ÇöÀúÈ÷ ³ôÀº ¼öÄ¡¸¦ º¸¿´°í pHÀÇ °æ¿ìµµ pH 5.5 ÀÌÇÏ¿¡¼ free GusA°¡ 12½Ã°£ ÈÄ ¾à 40% È°¼º¸¸ º¸ÀÎ ¹Ý¸é GusA-CBD´Â 12½Ã°£ ÈÄ¿¡µµ °è¼ÓÇؼ È°¼ºÀ» º¸¿´´Ù (±×¸² 4). ¶ÇÇÑ methanol solvent¿Í protinase K¿¡ ´ëÇÑ ¾ÈÁ¤¼ºÀ» ÃøÁ¤ÇØ º» °á°ú µ¿ÀÏ methanol ³óµµ Á¶°Ç¿¡¼ GusA-CBD°¡ free GusA¿¡ ºñÇØ 30% ³ôÀº È°¼ºÀ» À¯ÁöÇÏ°í ÀÖ¾úÀ¸¸ç protinase K 0.5mg/mL ÀÌ»óÀÇ ³óµµ¿¡¼ fre GusAÀÇ °æ¿ì ¿ÏÀüÈ÷ È°¼ºÀ» ÀÒ¾úÁö¸¸ GusA-CBDÀÇ °æ¿ì °è¼ÓÇؼ È°¼ºÀÌ ³²¾Æ ÀÖÀ½À» º¸¿´´Ù (±×¸² 4).
±×¸² 4. ´Ù¾çÇÑ pH¿Í protinase K ³óµµ Á¶°Ç¿¡ ÀÇÇÑ GusA (open circle)¿Í GusA-CBD (closed circle)ÀÇ È°¼º ÃøÁ¤
3. ¿¬±¸ÀÇ ¼º°ú ¹× ÀÇÀÇ
¹ÙÀÌ¿À»ê¾÷ÀÇ Ãø¸é¿¡¼ È¿¼ÒÀÇ ¾ÈÁ¤¼ºÀ» ³ôÀÌ´Â ¿¬±¸´Â ¹ÝÀÀ »ý»ê¹°ÀÇ °æÁ¦¼º°ú Á÷Á¢ÀûÀ¸·Î ¿¬°üµÈ ¸Å¿ì Áß¿äÇÑ À̽´ Áß ÇϳªÀÌ´Ù. º» ¿¬±¸¿¡¼ »ç¿ëµÈ E. coli À¯·¡ GusA ¶ÇÇÑ ±× ¾ÈÁ¤¼ºÀ» Çâ»ó½ÃÅ°±â À§ÇØ ´Ù¾çÇÑ ¹æ¹ýÀ¸·Î °³·®ÀÌ µÇ¾î¿ÔÀ¸³ª ¿©ÀüÈ÷ ³ôÀº ºñÀ²ÀÇ false positive·Î ÀÎÇÑ °è·®ÀÇ ÇÑ°è°¡ ¾Ë·ÁÁ® ÀÖ´Ù. º» ¿¬±¸¿¡¼´Â °£´ÜÈ÷ GusAÀÇ C¸»´Ü¿¡ CBD¸¦ À¶ÇÕÇÏ¿© GusA°¡ ³ôÀº ¾ÈÁ¤¼ºÀ» °®°Ô µÇ´Â Ư¼ºµéÀ» °üÂûÇÒ ¼ö ÀÖ¾ú´Ù. ƯÈ÷ °í¿Â¿¡¼ ¾ÈÁ¤ÇÑ GusA º¯À̸¦ Ž»öÇÏ´Â ¿¬±¸¿¡¼ [4] GusA°¡ oligomerizationÀ» Çü¼ºÇÏ´Â °ÍÀÌ monomer·Î ºü¸£°Ô µ¹¾Æ°¡·Á´Â ¼ºÁúÀ» ¸·¾Æ GusAÀÇ ¾ÈÁ¤¼º Áõ°¡ÀÇ Áß¿äÇÑ ¿ªÇÒÀ» ÇÏ´Â °ÍÀ¸·Î ¾Ë·ÁÁ® ÀÖÀ¸³ª ÀÌ ¶ÇÇÑ 70µµ À̻󿡼´Â ´Ù½Ã monomer·Î ÀüȯµÇ¾î ¾ÈÁ¤¼ºÀÌ ¶³¾îÁö´Â ¹®Á¦°¡ ÀÖÀ½À» È®ÀÎÇß´Ù. º» ¿¬±¸ÀÇ GusA-CBDÀÇ °æ¿ì 70µµ À̻󿡼µµ oligomer »óŸ¦ À¯ÁöÇÏ´Â °ÍÀ» È®ÀÎÇßÀ¸¸ç ÀÌ´Â CBDÀÇ È°¼ºÇü ÀÀÁýü ¼ºÁú¿¡ ÀÇÇÑ ¾ÈÁ¤¼º È¿°úÀÇ Áõ°¡¶ó°í º¼ ¼ö ÀÖ´Ù. µû¶ó¼ GusA ¿Ü ´Ù¾çÇÑ È¿¼ÒÀÇ CBD¿ÍÀÇ À¶ÇÕÀ¸·Î E. coli ³»¿¡¼ À̵éÀÇ °íÁ¤È È¿°ú¸¦ ±â´ëÇÒ ¼ö ÀÖÀ¸¸ç ÀÌ·Î ÀÎÇÑ Ã¤³Î¸µ È¿°ú·Î ´ë»ç ¹ÝÀÀÀÇ ¼Óµµ ¹× È¿À²À» Áõ°¡½Ãų ¼ö ÀÖ´Â Áß¿äÇÑ °¡´É¼ºÀ» Á¦½ÃÇÏ°í ÀÖ´Ù.
Âü°í¹®Çå
1. Choi S-L, Lee SJ, Yeom S-J, Kim HJ, Rhee YH, Jung H-C, et al. (2014) Controlled localization of functionally active proteins to inclusion bodies using leucine zippers. PLoS ONE 9: e97093. doi: 10.1371/ journal.pone.0097093 PMID: 24897378
2. Choi S-L, Lee SJ, Ha J-S, Song JJ, Rhee YH, Lee S-G (2011) Generation of catalytic protein particles in Escherichia coli cells using the cellulose-binding domain from Cellulomonas fimi as a fusion partner. Biotechnology and Bioprocess Engineering 16: 1173?1179
3. Mantis Joanna, Tague BW (2000) Comparing the utility of¥â-glucuronidase and green fluorescent protein for detection of weak promoter activity in Arabidopsis thaliana Plant Molecular Biology Reporter 18: 319?330
4. Xiong A-S, Peng R-H, Zhuang J, Chen J-M, Zhang B, Zhang J, et al. (2011) A thermostable b-glucuronidase obtained by directed evolution as a reporter gene in transgenic plants. Plos one 6: e26773. doi: 10.1371/journal.pone.0026773 PMID: 22096498