방선균 Streptomyces clavuligerus의 일차 전사체 및 번역체 분석을 통한

 유전체 상의 전사, 번역 조절 요소 규명

Hwang, S., Lee, N., Jeong, Y., Lee, Y., Kim, W., Cho, S., Palsson, B., Cho, B.K. (2019) Primary transcriptome and translatome analysis determines transcriptional and translational regulatory elements encoded in the Streptomyces clavuligerus genome, Nucleic Acids Res, gkz471, https://doi.org/10.1093/nar/gkz471

1. 연구배경

방선균 (Streptomyces) 은 높은 GC 함량의 유전체를 가진 그람 양성균이며, 종마다 다양한 항생제, 항면역제, 항진균제, 항암제 등의 이차 대사물을 생산할 수 있는 능력이 있어 이들을 바이오 합성하는 산업 균주로써 각광받고 있다. 이러한 이차 대사물은 방선균의 CoA 나 아미노산 등의 일차 대사 산물을 전구체로 하여, 복잡한 구조의 효소 복합체들에 의해 여러 단계를 거쳐 만들어 진다. 효소 복합체 정보가 담겨있는 유전자들은 보통 유전체 상에서 서로 밀집되어 클러스터 형태로 존재하는 경우가 많은데, 이것을 이차 대사물 생산 유전자 클러스터라고 한다. 최근 유전체 전체 서열을 분석하는 차세대 시퀀싱 기술을 적용한 결과, 한 종 당 약 30 여개의 다른 클러스터가 존재함이 밝혀졌는데, 이들 대부분은 실험실 조건 상에서 발현이 되지 않고 있다. 새로운 유용한 이차 대사물을 발굴하기 위해서는 이러한 BGC 들을 발현시키는 것이 필요하고, 그를 위해서는 클러스터의 발현을 조절하는 복잡한 조절 요소들에 대한 이해가 필요하다. 하지만 이러한 발현 조절에 대한 정보가 매우 부족한 실정이다. 따라서 유전체 수준 정보와 그것을 통한 발현 조절 요소를 찾는 것이 급선무이다 (그림 1).

2. 연구내용

본 연구에서는 방선균 종 중 β-lactam 계열 항생제 생산 균주인 Streptomyces clavuligerus 에 대해서 멀티 오믹스 데이터 (genome-seq, RNA-seq, ribosome profiling, and dRNA-seq) 를 얻고, 그를 융합하여 유전체 수준의 여러 가지 전사, 번역 조절 요소들을 밝혀 이차 대사물 생산 유전자들의 발현 조절을 좀 더 깊이 이해하고자 했다. (그림 2)

□ 유전체 서열 지도 완성 및 58 개의 이차 대사물 생산 유전자 클러스터 규명

긴 길이의 read 를 사용하는 PacBio sequencing 과 짧은 길이의 대용량 read 를 사용하는 Illumina sequencing 결과를 융합하여 S. clavuligerus의 전체 유전체 서열을 높은 정확도로 완성했다. 이는 기존에 연속된 미지의 서열 (N) 으로 다수 연결되어 있던 불완전한 유전체 서열을 하나의 연결된 서열로 수정했으며, 이를 기반으로 RefSeq annotation 알고리즘을 이용해 약 2 천 여 개의 유전자 annotation 을 새로이 수정하였다. 이 수정한 정보는 유전자 기능 면, RNA, RPF (ribosome protected fragment) profile 면에서 더 정확함을 확인했다. 또한 얻은 정확한 유전체 서열을 기반으로 antiSMASH 라는 프로그램을 이용해 유전체 상에 존재하는 모든 이차 대사물 생산 유전자 클러스터를 예측했고, 58개의 매우 많은 클러스터가 규명 되었다 (그림3). 이는 알려진 방선균 종 중 가장 많은 수의 클러스터 이므로, 새로운 유용한 이차 대사물을 발굴할 수 있는 가능성이 큰 균주임을 시사한다.

□ 유전체 수준 전사 시작점 결정을 통한 프로모터 상의 발현 조절 요소 규명

프로모터 상의 발현 조절 요소 규명을 위해 먼저 dRNA-seq 데이터를 분석하여 S. clavuligerus 2,659 개의 전사 시작점을 결정했고, 그 지점을 기준으로 상위에 존재하는 프로모터의 요소들을 먼저 살펴보았다 (그림 4).

전체적으로 ANNNT 서열의 -10 motif 가 높은 비율로 보존되어 있었고, TGAC 의 -35 motif 가 상대적으로 낮은 비율로 보존 되어있음을 확인했다. 이 두 motif 사이의 길이를 spacer 라고 하는데, 이 길이의 분포가 18-19 nt 에 주로 나타났고, 12 nt 에도 두번째로 높은 값을 나타냈다. 이 spacer length 에 따라 프로모터의 그룹을 나누어서 그 프로모터의 보존 서열을 분석해 본 결과, -10 motif 는 비슷하지만 -35 motif 는 조금씩 차이가 있는 것을 확인했다.

이 프로모터 motif 는 결국 하위의 유전자 발현을 조절하는 데 영향을 주기 때문에 유전자의 기능의 차이가 있는지 살펴본 결과, spacer 길이가 12 nt 인 것은 DNA 복제 및 수정 기능을 가진 유전자가 많은 것을 볼 수 있었다. 따라서 전사 시작점을 결정함으로써 전체적인 프로모터의 서열 특징을 파악했고, -35 motif 가 다양하게 나타나며 그것이 하위 유전자 기능과 연관되어 있는 것을 밝혔다.

□ 프로모터 서열 분석을 통한 다양한 σ-factor 의 potential regulon 예측

프로모터 서열 상의 조절 요소는 σ-factor 의 직접적인 인식 및 결합 부위로써 작용하여 전사가 시작되어 유전자 발현 여부와 양에 대한 결과를 나타낸다. 따라서 다양한 -35 motif 는 다양한 종류의 다른 σ-factor 결합을 일으키고, 그로 인해 전사 수준에서 다양한 유전자 발현 조절이 이루어지게 될 것으로 예상되었다. 특히 방선균에서는 7종류의 σ-factor 가 존재하는 대장균과 비교해서 약 50-60 여 개의 매우 많은 수의 σ-factor 를 가지고 있는데, 이는 다양한 프로모터 서열에 다양한 σ-factor 가 작용해 복잡한 발현 조절이 일어날 것이라는 추측을 할 수 있다.

그래서 각 σ-factor 가 작용하는 프로모터 서열을 예측하기 위해 σ-factor 의 프로모터 서열과 비슷한 프로모터를 검색하여, 그 유전자들이 해당 σ-factor 가 발현을 조절하는 potential regulon 이라고 예측하였다. 이들은 대부분 -10 motif 는 ANNNT 로 잘 보존되어 있었지만, -35 motif 서열은 모두 다양한 것을 알 수 있었다. 그 중 몇 개의 regulon 상의 유전자들의 기능을 보았을 때 비슷한 기능을 가지는 것들이 있었는데, 예를 들어 CRV15_09470 의 potential regulon 에는 DNA 복제 및 수정 기능의 유전자가 높은 비율로 존재했으며, CRV15_24810 의 경우는 arginine degradation 에 관련된 유전자가 높은 비율로 존재함을 확인했다 (그림 5).

따라서 프로모터 서열, 특히 -35 motif 부분이 다양하게 나타나는데, 이는 다양한 σ-factor 의 인식과 결합을 유도하며, 각 σ-factor 가 특정 기능을 가진 유전자들의 발현을 조절하는 경향이 있는 것으로 보여졌다.

□ 전사체 및 번역체 분석을 통한 유전자 기능별 발현 양상과 번역 효율의 차이 분석

유전자의 전사 조절 요소를 살펴보았으므로, 실제로 어떻게 발현 양상이 변화 하였는지를 알아보기 위해 S. clavuligerus 의 생장 시기에 따른 전사체 및 번역체의 변화 패턴을 분석했다. 전체 유전자의 발현 패턴은 크게 early-exponential phase 에 대한 later phase 의 발현양의 변화 패턴에 따라 (i) 증가하는 패턴, (ii) 감소하는 패턴, (iii) 유의한 변화가 없는 패턴으로 나뉘었다. 유전자 정보 저장 및 복제 등에 관련된 유전자들은 상대적으로 유의한 발현양 변화를 나타내지 않은 반면, 세포 내 물질 대사나 운반 등에 관련된 유전자들은 유의한 발현양의 변화를 보였다. 특히 이차 대사와 관련된 유전자들은 대부분 later phase 로 갈수록 발현양이 높아지는 패턴을 보여, 기존의 연구들과 일관된 결과를 나타냈다. 반면, 번역과 관련된 유전자들은 later phase 로 갈수록 발현양이 감소하는 패턴을 보였는데, 번역체 분석을 진행해 본 결과 전체적으로 증가한 RNA가 later phase 로 갈수록 번역되는 효율이 감소하는 것을 알 수 있었다.

특히 이차 대사물 생산 유전자 클러스터 내의 유전자들은 later phase 로 갈수록 전사되는 양이 증가하지만 그에 비해 번역되는 양은 덜 증가해 번역 효율이 많이 떨어지는 현상을 보였고, 이는 기존의 다른 방선균 (S. coeilcolor) 에서 나타난 현상과 일관된 결과였다 (그림 6). 따라서 전체적인 전사체 및 번역체 분석을 통해 유전자들의 발현 패턴 양상을 파악할 수 있었고, 그 예시로 이차 대사 유전자들의 번역 효율 감소 현상 (translational buffering) 을 관찰해 이차 대사물 생산 향상을 위한 잠재적 유전자 편집 타겟을 확인할 수 있었다.

□ 5’ 비해독부위 (5’-UTR) 상의 발현 조절 요소 분석

전사 시작점의 하위 서열에는 5’ 비해독부위 (5’-UTR) 가 존재하는데, 이 부분은 리보좀 결합 부위를 포함하고 있어 주로 번역 조절에 영향을 준다고 알려져 있다. S. clavuligerus 에서 이 5’-UTR 의 길이 분포를 살펴본 결과, 특이하게 0-9 nt 의 짧은 5’-UTR 을 가지는 경우가 전체의 20% 정도로 많은 것을 볼 수 있었는데, 이는 방선균에서 주로 나타나는 leaderless RNA 로 보여졌다. 이 leaderless RNA 는 리보좀 결합 서열 (RBS) 을 포함하고 있지 않아, 일반적인 번역 개시 기작과는 달리 개시 tRNA 와 AUG 개시 코돈 간의 결합이 매우 중요하게 작용한다고 알려져 있다. 실제로 확인해 본 결과 leaderless RNA 에서 AUG 개시 코돈을 가진 경우가 그렇지 않은 경우에 비해 높은 번역 효율을 나타냈다. 또, 개시 코돈을 기준으로 하위 서열까지의 RNA 결합 에너지를 계산해 본 결과, leaderless RNA 는 5’-UTR 을 가진 RNA 보다 약한 결합을 보여주어, RBS 가 없어도 수월한 번역 개시가 일어날 것으로 보였고, 반대로 강한 결합을 보이는 RNA 들은 진화적으로 5’-UTR 을 얻음으로써 용이한 번역 개시 조절을 하게 된 것으로 생각되었다 (그림 7). 결과적으로 5’-UTR 의 길이에 따라 다른 번역 조절을 받을 가능성을 제시했다.

□ β-lactam 계열 항생제 생산 경로 상의 potential regulon 예측

S. clavuligerus 는 β-lactam 계열 항생제 저항 효소를 저해하는 물질인 clavulanic acid 와 β-lactam 계열 항생제인 cephamycin C, 그리고 여러 가지 clavam 들을 만드는 균주인데, 앞서 밝혀낸 유전자 발현 조절 요소들이 이들의 생산 경로 상에서 어떻게 나타나는지를 살펴보았다 (그림 8).

β-lactam 계열 항생제 생산에 관련된 모든 유전자들에 대해서 프로모터 서열을 분석해 본 결과, 2개의 potential regulon 이 예측되었는데, 첫 번 째 regulon 은 cephamycin C, clavulanic acid 생산 클러스터 내의 유전자 뿐만 아니라 각각의 전구체로 작용하는 arginine, valine 을 피루브산 으로부터 만드는 과정에 속해있는 유전자까지 광범위하게 포함하고 있었으며, 발현 패턴은 생장이 진행될수록 약간 증가하는 공통된 패턴을 보였다. 또한 두 번 째 regulon 은 주로 arginine 생산 경로 상의 유전자가 다수 포함되어 있었고, 이들의 발현 패턴은 오히려 early-exponential phase 에 비해 later phase 에서 감소하는 양상을 보였다. Arginine 이 clavulanic acid 의 전구체이기 때문에 clavulanic acid 의 생산을 향상시키기 위해서는 이 유전자들이 발현 조절 엔지니어링의 타겟이 되어야 할 것으로 생각되었다.

3. 연구의 성과 및 의의

본 연구에서는 S. clavuligerus 의 유전체 서열 지도를 완성시키고, 그를 기반으로 전사 시작점, 전사체, 번역체를 높은 퀄리티로 분석하여 여러 가지 전사 및 번역 조절 요소들을 밝혀냈다. 특히 유전체 서열 지도를 완성함으로 인해 58 개의 이차 대사물 생산 유전자 클러스터를 예측하였으며, 전사 시작점 결정을 통해 프로모터 상에 존재하는 서열이 다양한 σ-factor 에 의해 조절되며, 그 하위의 유전자들은 유사한 기능을 가지는 경우가 많다는 것을 확인했다.

또한 이차 대사물 생산 유전자 클러스터 내의 유전자는 특히 전사되는 양에 비해 번역 효율이 낮은 상태라는 것을 밝혔으며, 번역 효율은 방선균의 짧은 5’-UTR 을 가지는 leaderless RNA 에서 AUG 개시 코돈의 유무에 의해 조절될 수 있다는 가능성을 제시했다. 마지막으로 S. clavuligerus 의 대표적인 이차 대사물인 β-lactam 계열 항생제들의 생산 경로를 분석하여 2개의 potential regulon 과 그들의 발현 양상을 살펴보아 추후 이차 대사물 생산 향상을 위한 타겟을 제시하였다. 이렇게 유전체 서열과 멀티 오믹스 데이터를 융합하여 여러 가지 전사 및 번역 조절 요소들을 밝힘으로써 새로운 이차 대사물 생산을 위한 엔지니어링 시 합리적인 디자인에 유용하게 이용될 수 있는 정보들을 대량 제공했다는 데에 큰 의의가 있다. 이를 통해 항생제 저항성 슈퍼 박테리아를 치료할 새로운 항생제를 발굴하는데 한걸음 나아갈 수 있을 것으로 전망된다.

참고문헌

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