생합성 된 엘도파(L-DOPA)의 유전적 도입 시스템 개발과 응용

서강대학교 이현수 교수

Kim S, Sung BH, Kim SC, Lee HS (2018). Genetic incorporation of L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chem. Comm. 54, 3002-3005.

1. 연구배경

엘도파는 도파민 생합성의 전구체로 파킨스병의 치료제로 사용되고 있는 아미노산이다. 엘도파의 카테콜(catechol) 작용기가 산화되어 형성되는 퀴논 (quinone)은 아민과 쉽게 반응하기 때문에 자연에서는 홍합의 접착력에 작용하는 접착단백질의 핵심 잔기로 사용되고 있고, 생화학 분야에서는 다양한 바이오컨쥬게이션 (bioconjugation)에 사용되고 있다. 이러한 다양한 응용성을 가지는 엘도파를 단백질에 효율적으로 도입할 수 있다면 다양한 생화학 분야에 응용될 수 있을 것으로 기대된다. 여기에 추가로 엘도파를 생합성하여 직접 단백질에 도입할 수 있으면 보다 경제적으로 엘도파를 포함한 단백질을 생합성 할 수 있고, 나아가 비천연 아미노산을 생합성하여 단백질에 도입하는 확장된 유전 코드를 사용하는 바이오 시스템을 구축할 수 있다.

2. 연구내용

□ 엘도파의 유전적 도입 시스템 구축

엘도파의 유전적 도입은 2003년도에 처음 보고 되었다. 그러나 이 시스템을 사용한 결과 다량의 티로신 (tyrosine)이 엘도파와 함께 도입 (약 50%)됨을 확인하였다. 따라서 엘도파에 대한 선택성을 높이기 위해 aminoacyl-tRNA synthetase (aaRS)의 변형체 라이브러리를 구축하여 스크리닝을 진행하였다. 여기서 찾은 aaRS 변형체를 사용하여 녹색형광단백질 (GFP)에 엘도파의 농도를 변화시키면서 도입을 시도하였고, GFP 형광과 질량 분석을 통해서 엘도파의 도입 효율과 선택성을 확인하였다 (그림 1). 그 결과 2배 정도의 효율 향상과 98% 이상의 엘도파 도입이 가능하게 되었다.

□ 엘도파의 생합성 및 유전적 도입 시스템 구축

엘도파의 생합성을 위해서 사용할 효소와 출발 물질을 모색하였다. 가장 먼저 시도한 효소는 티로시네이즈 (tyrosinase)였고, 티로신을 출발 물질로 사용하였다. 이 경우에 다량의 티로신이 필요하여 유전적 도입 시에 엘도파와 티로신이 경쟁적으로 도입되는 결과를 확인하였다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 시도한 효소는 티로신페놀라이에이즈 (TPL, tyrosine phenol-lyase)였고, 출발 물질은 카테콜, 피루베이트 (pyruvate), 암모니아였다. TPL은 구조와 기능이 잘 알려진 효소였고, 정제된 TPL을 사용하여 엘도파의 합성에도 사용된 경우가 보고되어 있었다. 세포 내에서 생합성하기 위해서는 고농도의 출발물질이 필요하고, 유전적 도입을 위해서는 엘도파에 해당하는 tRNA와 aaRS도 함께 발현해 주어야 했다. 이러한 세포를 구현하기 위해서 그림 2 와 같이 엘도파의 생합성과 유전적 도입이 가능한 시스템을 디자인하였다.

정제된 TPL을 이용한 엘도파의 생합성 조건 (기 보고된 조건)은 세포 내에서의 생합성에 사용될 수가 없기 때문에 세포내 생합성 조건의 최적화를 시도를 하였다. TPL의 생합성 반응은 출발물질과 생성물질이 평형상태로 존재하기 때문에 엘도파의 합성 수율을 극대화하기 위해서는 카테콜, 피루베이트, 암모니아를 가능한 최고 농도로 사용해야 한다. 각 출발물질들의 농도를 변화해 가면서 생합성 된 엘도파가 GFP에 도입되는 정도를 형광으로 분석하였다. 그 결과 피루베이트 100 mM과 암모니아 25 mM 이상에서는 형광 증가가 없었고, 카테콜의 경우는 독성으로 인해서 10 mM을 초과해서는 사용할 수 없었다. 이러한 조건으로 생합성된 엘도파를 GFP에 도입한 결과가 그림 3A에 나타나 있다.

각 조건에서 발현된 엘도파를 포함한 GFP를 정제하여 질량 분석을 통해 엘도파의 도입 정도를 확인한 결과 카테콜을 10 mM 사용했을 경우 98% 이상 도입됨을 확인할 수 있었다. 엘도파 8 mM 농도에서 가장 높은 GFP 형광이 관찰되었으나 질량분석 결과, 소량 (20%)의 티로신 도입이 관찰되었고, GFP 형광은 다소 낮지만 10 mM에서 더 높은 선택성을 보였다 (그림 3B).

실제 정제된 단백질의 수율의 비교를 위해 다른 카테콜 농도에서 생합성된 엘도파를 포함한 GFP 발현 및 정제하였다. 그리고, 생합성을 통해 발현한 GFP 수율을 엘도파를 이용해서 발현한 GFP의 수율과 비교하였다 (표 1). 형광 세기와 선택성 측면에서 엘도파를 사용할 때와 카테콜로부터 생합성을 할 때는 큰 차이는 없었지만, 엘도파의 독성으로 인해서 엘도파를 사용할 때 세포의 양에서 큰 차이가 났고, 그 결과 2-5배 정도 차이로 생합성 시에 더 높은 수율로 GFP를 얻을 수 있었다.

표 1. 기존의 엘도파 도입 시스템 (DOPA)과 생합성을 이용한 도입 시스템 (Catechol)의 단백질 수율 비교.

□ 엘도파의 생합성 및 유전적 도입 시스템의 활용

엘도파는 엘도파퀴논 (L-dopaquinone)으로 쉽게 산화가 되고, 이 퀴논은 알카인 (alkyne)이나 아민 (amine), 티올 (thiol) 등과 잘 반응하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서 개발된 엘도파 생합성 및 유전적 도입 시스템의 유용성을 확인하기 위해 엘도파를 포함한 변형 단백질을 다양한 바이오컨쥬게이션 (bioconjugation)에 활용하였다. 첫 번째로 스트레인드 알카인 (strained alkyne)을 이용한 고리화 반응 (cyclization reaction)에 활용하였다. 말토즈 결합 단백질 (MBP, maltose-binding protein)의 313번 위치에 엘도파를 도입하고, Cy5.5가 연결된 azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-ADIBO)이 존재하는 조건에서 엘도파를 산화 (NaIO4 사용)시켜 고리화 반응을 진행하였다 (그림 4A). 그 결과 시간에 따른 표지 수율의 증가가 관찰되었고, 1시간 반응 후에 85-90%의 단백질이 표지됨을 질량 분석을 통해서 확인할 수 있었다.

다음으로 엘도파를 포함한 단백질의 단백질 간 컨쥬게이션을 시도하였다. 카테콜의 산화로 형성된 퀴논은 아민이나 티올과 쉽게 반응할 수 있는데, 이 반응을 이용하여 단백질 중합 반응 (polymerization reaction)을 확인하였다. MBP의 83번 위치에 엘도파를 도입하고, NaIO4를 통해 산화시켜 반응을 진행하면, 48시간 후에 MBP 중합체의 형성을 확인할 수 있었다 (그림 4B). MBP에는 36개의 라이신이 존재하는데 이들과 엘도파퀴논이 반응하여 중합체를 형성한 것으로 예상된다. 이 반응의 경우 선택성이 없이 무작위적으로 반응이 진행되는 것으로 생각되었고, 이를 개선하기 위해서 단백질의 상호작용을 이용한 단백질간 컨쥬게이션을 시도하였다. 서로 상호작용을 하는 단백질 짝으로는 어피바디 (affibody)와 지도메인 (Z-domain) 단백질을 사용하였다. 엘도파는 어피바디의 36번 위치에 도입하였고, 엘도파와 반응할 잔기로는 지도메인의 6번 잔기를 선택하였다. 그리고, 원래의 아스파라긴 잔기 (Asn6)를 라이신으로 변형하였다. 이렇게 디자인된 단백질들을 발현 정제하여 상호작용을 이용한 컨쥬게이션 실험을 진행한 결과 70% 이상의 단백질간 켠쥬게이션을 확인할 수 있었다 (그림 4C). 이러한 컨쥬게이션 효율은 문헌에 보고된 최고 수준에 해당된다.

3. 기대효과

본 연구에서는 엘도파를 세포 내에서 생합성하는 조건을 확립하고, 생합성된 엘도파가 곧바로 유전적으로 단백질에 도입되는 시스템을 구축하였다. 이를 통해서 엘도파를 포함한 단백질을 저비용 대량생산할 수 있는 기술이 확보되었다. 또한 위치 선택적으로 단백질에 도입된 엘도파를 활용하여 위치 선택적 단백질 표지와 단백질 간 컨쥬게이션에 응용함으로써 본 기술이 다양한 단백질 표지에 응용될 수 있음을 증명하였다.

참고문헌
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